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固相合成技术因其操作简便、易于实现自动化，已成为合成小核酸和多肽药物的常用方法之一。近年来，微波辅助合成和流动合成技术的引入进一步提升了固相合成的合成效率和产量。然而，这些技术通常依赖昂贵且高度专业化的仪器，限制了其在常规实验室中的普及。此外，现在在Fmoc固相合成中广泛使用的活化试剂HATU，存在热稳定性差和安全隐患。

鉴于此，瑞士日内瓦大学Nicolas Winssinger团队利用通用的液相分析系统，顺利获得将其改造用于流动化学技术，实现高效液相色谱仪（HPLC）到多肽合成仪的转变。

HPLC是常用的分离分析技术，样品经色谱柱分离组分，实现样品的纯度检测。该团队创新的在色谱柱前的保护柱中填充10mg树脂作为微型流动反应器，内置2 μm熔块，以防止树脂流失，同时借助DAD检测器（检测Fmoc脱保护副产物）实时反馈合成结果。

该方案采用TBEC（1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺）/Oxyma（2-肟氰乙酸乙酯）作为活化体系，无需额外加碱和预活化步骤，不仅简化了流程，还更加的安全和环保。

在上述设备和活化体系基础上，为探索合成条件，以苯丙氨酸五聚体为模型，在改造的HPLC系统上进行优化条件。实验结果表明，经优化后的条件可成功合成目标五肽，且实现粗品纯度＞93%单步纯度＞99%。

具体方法如下：

整个合成流程包括如下几个阶段：

1. 称重及负载树脂：称取10 mg树脂（如Rink Amide树脂）填入空保护柱中，密封固定；

2. 树脂溶胀：将负载树脂的保护柱浸入二氯甲烷中，溶胀3-5分钟；

3. 安装：设置柱温箱温度为80℃，并将保护柱安装至对应支架中；

4. 试剂溶液配备：

样品溶液：配置0.6 M Fmoc氨基酸、TBEC和Oxyma的NMP溶液，并等体积混合得到0.2M溶液；

脱保护溶液：在DMF中加入20%体积的哌啶，转入自动进样器小瓶中备用；

5. 编写注射序列程序：设置仪器交替注射，活化的氨基酸衍生物溶液（用于偶联）和20%哌啶的DMF溶液（用于脱保护）；另外，在合成开始前，需陆续在进行两次脱保护，以确保初始Fmoc基团完全去除。

6. 树脂裂解和脱保护：将保护柱浸入二氯甲烷中去除残余DMF；然后取出树脂，浸没在TFA溶液中（TFA/三异丙基硅烷TIS/H2O=95:2.5:2.5），反应3小时，以达到完全解离和脱保护。对于含半胱氨酸，甲硫氨酸等的特殊序列，可使用TFA/1,2-乙二硫醇EDT / TIS / H2O=90 : 5 : 2.5 : 2.5混合裂解液。

7. 产物处理：分离树脂，使多肽粗品析出，进一步纯化。

对于组氨酸等易消旋的氨基酸及部分特殊氨基酸而言，预活化时间对其偶联效率具有显著影响：该团队在合成20肽时，比较了新制活性酯和预活化24小时后打的偶联效率，发现Fmoc-Arg(pbf)-OH和Fmoc-His(Trt)-OH在长时间活化后偶联效率比较低。

为进一步研究预活化时间对偶联效率的影响，以Fmoc-Arg(pbf)-OH为原料分别在预活化15分钟和24小时后合成FRF三肽。结果显示，预活化24小时后，偶联效率显著降低，归其原因是Fmoc-Arg(pbf)-OH在活化后，会经历分子内环化，降低其反应性。经反复试验验证，理想的活化溶液应在制备4小时内使用。

肽合成过程中的异构化可能会影响立体化学纯度并改变生物活性。为评估在该合成条件下的消旋化程度，该团队采用液相合成方法，对脯氨酸、半胱氨酸和丝氨酸等易消旋的氨基酸进行考察，均未发现消旋化现象。进一步比较TBEC/Oxyma体系和HATU/DIPEA体系的偶联效果，团队采用新鲜活化的His(Trt)进行反应，实验发现前者差向异构化为3.6%，而后者异构化比例为4.8%。

该团队成功合成了GLP-1（30氨基酸）和比伐卢定（20氨基酸）等多肽，其中使用含10 mg树脂的合成柱合成GLP-1的收率为52.1%。而在生物活性方面，用HPLC合成的比伐卢定粗品和顺利获得常规SPPS合成的比伐卢定纯品具有相似的生物活性（见下图）。

现成的HPLC应用于自动化流体合成多肽，具有以下优势和不足之处：

1. 优势：

• 将标准HPLC转变为多功能合成平台；

• 采用更安全的TBEC/Oxyma活化体系；

• 可取得高纯度多肽，同时能够实时监控反应；

• 立体选择性好，可合成复杂序列多肽；

• 经济性好，采用广泛可用的HPLC设备，降低设备成本，可惠及更多实验室；

• 灵活性高，可用于多肽/寡核苷酸的合成，还可以顺利获得更换柱子在合成和纯化模式之间切换。

2. 局限性：

• 对某些复杂序列无法合成；

• 不同的氨基酸或肽链之间的反应速率存在差异，需进一步优化；

• 合成量较小，仅适用于微克至毫克级的合成。

该研究给予了一种简单、安全且经济的多肽合成平台，利用常规HPLC系统，实现了反应和检测的同步进行。此方案不仅保持了产物的立体化学完整性，还可以合成具有生物活性的复杂序列片段，有助于有助于流动合成技术在更多实验室中的普及。

经过22年的不懈努力和积累，Ezpay生物在全球多肽合成试剂领域持续深耕，现已开展成为具有广泛定制产品覆盖能力和显著规模化生产优势的领先企业，可以满足各类客户的特定需求。我们诚挚邀请对该产品感兴趣的客户与我们联系，以便进一步分析产品详情，并探讨合作机会。

参考文献：

[1] Romanens, P.; Barluenga, M. D.; Winssinger, N., et al. Peptides on Tap: Automated Flow Synthesis with Standard HPLC [J]. ChemRxiv. 2025.